PEMBUATAN MEDIUM FERMENTASI DAN PENENTUAN ZONA BENING

I.       PENDAHULUAN

1.1  Latar Belakang

Media merupakan bahan yang digunakan untuk mengembang biakkan bakteri laboratorium secara in vitro. Sebelum digunakan, media harus dalam keadaan steril. Artinya tidak ditumbuhi oleh mikroba lain yang tidak diharapkan. Antibiotik/antimikroba adalah suatu substansi kimia yang dibentuk atau diperoleh dari berbagai spesies mikroorganisme, yang dalam konsentrasi rendah mampu menghambat pertumbuhan mikroorganisme lainnya. Pertumbuhan mikroorganisme yang terhambat dapat ditentukan dengan mengukur zona bening yang terbentuk pada sekitaran paper disc (kertas cakram) yang mengndung antibiotik/antimikroba.

Oleh karena itu, untuk menentukan ada atau tidaknya pertumbuhan mikroorganisme perlu dilakukan pembuatan medium fermentasinya dan penentuan dari zona bening itu sendiri.

1.2    Tujuan

1.      Melatih keterampilan dalam pembuatan medum fermentasi cair.

2.      Melatih keterampilan dalam menginokulasi mikroorganisme ke dalam medium.

3.      Mengamati zona bening sebagai representasi potensi suatu mikroorganisme terhadap substrat.

4.      Melath keterampilan untuk bekerja secara aseptis.

1.3    Aplikasi

Aplikasi pembuatan media fermentasi ini sangat diperlukan pada saat ini. Contohnya Industri fermentasi yang semakin meningkat jumlahnya, sehingga dibutuhkan media fermentasi yang lebih banyak lagi untuk mikroorganisme-mikroorganisme yang baru.

II.       TINJAUAN PUSTAKA

Salah satu keutamaan probiotik adalah bersifat sebagai antimikroba, dimana metabolit sekunder yang dihasilkan dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen. Beberapa probiotik yang terdapat pada tubuh manusia adalah Helicobacter pylory, E. coli, dan Salmonela.^[1]

Antibiotik/antimikroba adalah suatu substansi kimia yang dibentuk atau diperoleh dari berbagai spesies mikroorganisme, yang dalam konsentrasi rendah mampu menghambat pertumbuhan mikroorganisme lainnya. Pertumbuhan mikroorganisme yang terhambat dapat ditentukan dengan mengukur zona bening yang terbentuk pada sekitaran paper disc yang mengandung antibiotik/antimikroba.

Antibiotik atau antimikroba ialah zat-zat yang dihasilkan oleh suatu mikroba, terutama golongan fungi (jamur), yang dapat menghambat atau membasmi mikroba jenis lain. Suatu obat antibiotik yang ideal menunjukkan toksisitas yang selektif.

Berdasarkan mekanisme kerja antibiotik dibagi dalam 3 kelompok : 

1.         Kerja antibiotik melalui penghambatan sintesis dinding sel, seperti Basitrasin, Sefalosporin, Sikloserin, Penisilin, Vankomisin.

2.          Kerja antibiotik melalui pengambatan fungsi membrane sel, seperti: Amfoterisin B, Kolistin, Imidazol, Nistatin, Polimiksin.

3.         Kerja antibiotik melalui penghambatan sintesis asam nukleat, seperti: Novobiosin, Pirimetamin, Sulfonamid, Trimetropin.

Berdasarkan sasaran kerja antibiotic dikelompokkan sebagai berikut:

1.         Antibiotik yang bekerja terhadap bakteri basil Gram positif.

2.         Antibiotik yang efektif terhadap basil aerob Gram negatif.

3.         Antibiotik yang relatif memiliki spektrum kerja yang luas (terhadap basil Gram negatif dan positif).^[4]

Berdasarkan sifat toksisitas selektif, ada antibiotik yang menghambat pertumbuhan mikroba dikenal sebagai aktivitas bakteriostatik, dan ada yang bersifat membunuh mikroba dikenal sebagai aktivitas bakterisid. Kadar minimal yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan mikroba atau membunuhnya masing-masing dikenal sebagai Kadar Hambat Minimal (KHM) dan Kadar Bunuh Minimal (KBM). Antibiotik tertentu aktivitasnya dapat meningkat dari bakteriostatik menjadi bakterisid bila kadar antimikrobanya ditingkatkan melebihi KHM.

Konsentrasi minimun penghambatan atau lebih dikenal dengan MIC (Minimum Inhibitory Concentration) atau disebut dengan KHM adalah konsentrasi terendah dari antibiotik atau antimikroba yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba tertentu. Nilai KHM adalah spesifik untuk tiap-tiap kombinasi dari antibiotik dan mikroba. KHM dari sebuah antibiotik terhadap mikroba digunakan untuk mengetahui sensitifitas dari mikroba terhadap antibiotik.

Nilai KHM berlawanan dengan sensitifitas mikroba yang diuji. Semakin rendah nilai KHM dari sebuah antibiotik, sensitifitas dari bakteri akan semakin besar. KHM dari sebuah antibiotik terhadap spesies mikroba adalah rata-rata KHM terhadap seluruh strain dari spesies tersebut. Strain dari beberapa spesies mikroba adalah sangat berbeda dalam hal sensitifitasnya. Metode uji antimikroba yang sering digunakan adalah metode Difusi Lempeng Agar. Uji ini dilakukan pada permukaan medium padat. Mikroba ditumbuhkan pada permukaan medium dan kertas saring yang berbentuk cakram yang telah mengandung mikroba. Setelah inkubasi diameter zona penghambatan diukur.  Diameter zona pengambatan merupakan pengukuran KHM secara tidak langsung dari antibiotik terhadap mikroba.^[4]

Metode umum dalam uji potensi antibiotik antara lain :

1.      Metode lempeng (silinder/kertas cakram).

Metode ini didasarkan pada difusi antibiotik dari silinder yang dipasang tegak lurus pada lapisan agar padat dalam cawan petri atau lempeng yang berisi biakan mikroba uji pada jumlah tertentu. Sediaan antibiotik menghambat pertumbuhan mikroba yang ada pada lempeng agar .

2.      Metode turbidimetri.

Hambatan pertumbuhan biakan mikroba dalam larutan serbasama antibiotik, dalam media cair yang dapat menumbuhkan mikroba dengan cepat bila tidak terdapat antibiotik metode turbidimetri dilakukan pada sampel yang sulit larut dalam air, contohnya : gramisidin.

Ada empat hal pokok yang harus diperhatikan dalam proses fermentasi yaitu mikroba, medium fermentasi, fermentor dan kondisi lingkungan. Seleksi terhadap jenis dan sifat serta jumlah inokulum yang akan ditambahkan akan menentukan kualitas dan kuantitas hasil fermentasi. Proses fermentasi dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu kadar gula, oksigen, pH, medium, CO₂, nitrogen, mineral, faktor tumbuh, suhu, tekanan medium dan tekanan udara.^[2]

Medium fermentasi adalah medium tumbuh mikroba yang menyediakan  nutrien yang dibutuhkan oleh mikroba untuk memperoleh energi, untuk pertumbuhan, membentuk sel dan biosintesa produk-produk metabolit. Media yang tidak sesuai akan menyebabkan perubahan jenis produk dan perubahan rasio diantara berbagai produk metabolisme. Medium yang digunakan sebagai tempat terjadinya proses fermentasi harus mengandung komponen nutrien yang lengkap sesuai dengan kebutuhan mikroba.

Fermentasi adalah suatu aktivitas mikroba baik aerob maupun anaerob untuk mendapatkan energi dimana terjadi perubahan atau transformasi kimiawi substrat organik. Secara kimiawi, perubahan bahan pangan selama fermentasi disebabkan oleh enzim. Enzim dapat dihasilkan oleh mikroba atau sudah terdapat dalam bahan pangan. Secara biokimia, fermentasi diartikan sebagai pembentukan energi melalui senyawa organik, sedangkan aplikasinya dalam dunia industri fermentasi diartikan sebagai suatu proses untuk mengubah bahan dasar menjadi suatu produk oleh massa sel mikroba. Di dalam pengertian ini termasuk juga proses anabolisme pembentukan komponen sel secara aerob.^[3]

Fermentasi pada umumnya menggunakan senyawa organik berupa karbohidrat yang dapat digolongkan sebagai berikut :

·         Bahan bergula, seperti tebu, molase, bit gula dan cairan buah-buahan

·         Bahan berpati, seperti jagung, ubi kayu dan kentang

·         Bahan berselulosa, seperti kayu dan berbagai limbah industri pertanian

Dalam fermentasi, bakteri asam laktat akan menfermentasikan bahan pangan untuk menghasilkan perubahan yang diinginkan dan yang terutama adalah terbentuknya asam laktat dimana asam laktat akan menurunkan nilai pH dari lingkungan pertumbuhannya dan menimbulkan rasa asam. Hal ini juga berakibat menghambat pertumbuhan dari beberapa jenis mikroorganisme patogen lainnya. Seperti telah disebutkan bahwa produk yang dihasilkan dari fermentasi bakteri asam laktat akan berbeda tergantung pada jenis bakteri asam laktatnya apakah homofermentatif atau heterofermentatif.^[3]

            Fermentasi adalah proses produksi energi dalam sel yang terjadi secara anaerob dengan atau tantap akseptor eksternal. Gula seperti glukosa, fruktosa dan sukrosa sebagai bahan dasar ketika difermentasi dalam kondisi anaerob akan menghasilkan etanol, asam laktat, asam butirat, aseton, dan hydrogen. Reaksi sederhana dari fermentasi adalah sebagai berikut :

C₂H₁₂O₆              2C₂H₅OH + 2CO₂ + 2 ATP (energi yang dilepaskan: 118 kJ/mol)

Fermentasi merupakan kegiatan mikroba pada bahan pangan untuk menghasilkan produk yang diinginkan. Mikroba yang umum ditemukan dalam fermentasi adalah bakteri, khamir, dan kapang. Fermentasi dapat dilakukan menggunakan kultur murni, kultur alami, kultur tunggal, dan kultur campuran. Fermentasi dengan menggunakan kultur alami umumnya dilakukan pada fermentasi tradisional yang memanfaatkan mikroorganisme yang ada di lingkungan. Kultur murni adalah mikroorganisme yang akan digunakan dalam fermentasi dengan sifat dan karakteristik dan telah diketahui dengan pasti, sehingga produk yang dihasilkan memiliki stabilitas dan kualitas yang jelas. Dalam proses fermentasi, kultur murni dapat digunakan secara tunggal ataupun secara campuran. ^[1]

Medium khusus untuk pertumbuhan BAL:

1.      Medium MRS agar

2.      Medium pepton water 10%

3.      Medium nutrient agar

III.     METODOLOGI PERCOBAAN

3.1    Alat dan Bahan

a.  Alat

Alat	Fungsi
Erlenmeyer	Untuk menampung larutan, bahan atau cairan.
Gelas ukur	Mengukur larutan yang diambil
Petridish	Sebagai wadah penyimpanan dan pembuatan kultur media.
Paperdisc	Sebagi alat yang terbuat dari kertas saring dan dicelupkan ke dalam cairan antibiotik.
Stirrer hot plate	Untuk memanaskan dan menghomogenkan larutan
Lampu spiritus	Sebagai pembakar
Pipet tetes	Untuk mengambil larutan
Pinset	Untuk menjepit atau mengambil paperdisc.
Autoclave	Untuk mensterilkan alat dan bahan

b.    Bahan

Bahan	Fungsi
BAL	Sebagai antibakteri
Isolat E. coli	Sebagai bakteri patogen
Daging	Sebagai sumber karbon
Agar	Sebagai pemadat
Akuades	Sebagai pelarut

3.2    Cara Kerja

·               Pembuatan medium fermentasi cair dan zona bening

1.            Siapkan semua bahan, potong daging kecil-kecil, ditimbang 1,25 gram dan dimasukkan kedalam Erlenmeyer, ditambahkan akuades 200 mL dan dipanaskan di atas hot plate sampai mendidih.

2.            Saring larutan yang dipanaskan. Siapkan 2 buah erlenmeyer, kaldu dibagi menjadi dua. Kaldu pertama diambil sebanyak 150 mL dan kaldu kedua diambil sebanyak 50 mL.

3.            Untuk kaldu pertama ditambahkan 3 gram agar, dipanaskan sambil distirer sampai mendidih. Ambil ekstrak daging dengan cara menyaring dengan kain kasa ke dalam erlenmeyer. Selanjutnya disterilisasi menggunakan autoclave.

4.            Untuk kaldu kedua ditutup dengan avo kemudian disterilisasi menggunakan autoclave.

5.            Larutan sampel untuk kaldu yang pertama setelah di autoclave, diletakkan pada petridish, dibiarkan sampai memadat.

6.            Ambil biakan E.coli, dipindahkan dengan cotton bath disebar secara keseluruhan pada petridish.

7.            Ambil 3 buah paperdisc dicelupkan kedalam BAL selama 40 s, 60 s dan 80 s. Setelah itu diletakkan diatas petridish.

8.            Untuk amoxilin diberi perlakuan yang sama dengan BAL, diletakkan diatas petridish dan diinkubasi selama 24 jam. Amati zona bening yang terbentuk.

9.            Untuk kaldu kedua yang telah disterilisasi, biakan diambil menggunakan jarum ose, disebar pada media cair dan diinkubasi selama 24 jam. Amati zona bening yang terbentuk.

3.3    Skema Kerja

·               Pembuatan medium fermentasi cair dan zona bening

Daging

-   Ditimbang 1,25 gram

-   Ditambahkan 200 mL akuades

-   Dipanaskan sampai mendidih

-    Disaring dengan kain kasa

 

Kaldu I (150 mL)                                                        Kaldu II (50 mL)

-         Ditambahkan 2 gram agar                                        - Dimasukkan dalam

-         Dipanaskan sambil distirer                                           erlenmeyer

-         Disterilisasi                                                                 - Ditutup dengan avo                                                                                                - Disterilisasi

Ekstrak daging                                                               Biakan

-         Dipisahkan                                                                 - Diambil dengan

-         Diautoclave                                                                   jarum ose

-   Disebar pada media

Larutan sampel                                                                          cair

-         Diletakkan pada petridish                                         - Diinkubasi 24 jam

-         Disebar secara keseluruhan                               Hasil

Paperdisc

-         Dicelupkan pada BAL

-         Didiamkan selama 40 s, 60 s, 80 s

-         Diletakkan di atas petridish

Amoxilin

-         Diberi perlakuan yang sama dengan BAL

-         Diletakkan di atas petridish

-         Diinkubasi selama 24 jam

Hasil

IV.     HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1    Hasil dan Pengamatan

a.        Pengamatan

No.	Foto	Pengamatan
1.		Pada medium cair, terlihat bakteri berupa suspense yang menyebar didasar Erlenmeyer.
2.		Pada medium padat dengan variasi waktu perendaman pada 40 s, 60 s dan 80 s pada BAL terdapat zona bening.
3.		Pada medium padat dengan variasi konsentrasi dari antibiotik yaitu 1 mg/mL, 2 mg/mL dan 3 mg/mL.

b.    Hasil

·         Variasi waktu

     Menggunakan Bakteri Asam Laktat (BAL)

Waktu	Diameter Horizontal
	I	II	III	IV
40 s	9 mm	8.5 mm	8.5 mm	10 mm
60 s	9 mm	9 mm	9 mm	9 mm
80 s	9 mm	8 mm	10 mm	8.5 mm

      Diameter cakram = 6,5 mm

1.      Untuk 40 s

Diameter zona bening =  = 9 mm

Indeks zona bening      =  = 3,84

2.      Untuk 60 s

Diameter zona bening  =  = 9 mm

Indeks zona bening      =  = 3,84

3.      Untuk 80 s

Diameter zona bening  =  = 8,875 mm

Indeks zona bening      =  = 3,65

·         Variasi Antibiotik

      Menggunakan antibiotik dengan waktu yang sama yaitu 60 s.

Jenis	I	II	III	IV
A10	10 mm	7 mm	8,5 mm	8,5 mm
A20	10 mm	10,5 mm	10 mm	11 mm
A30	11 mm	9 mm	12 mm	11 mm

1.      Untuk A₁₀

-      Diameter zona bening

 = 1 mg/mL =  = 8,5 mm

-      Indeks zona bening =   = 3,07

2.      Untuk A₂₀

-      Diameter zona bening

 = 2 mg/mL =  = 10,375 mm

-      Indeks zona bening =   = 5,96

3.      Untuk A₃₀

-      Diameter zona bening

 = 3 mg/mL =  = 10,75 mm

4.      Indeks zona bening =   = 6,54

         

4.2    Pembahasan

Pada praktikum kali ini berjudul “Pembuuatan Media Fermentasi dan Penentuan Zona Bening” mempunyai tujuan untuk melatih keterampilan membuat medium fermentasi cair dan menginokulasikan mikroorganisme ke medium, serta mengamati zona bening sebagai representasi potensi suatu mikroorganisme terhadap substrat.

            Pada percobaan ini dibuat 2 medium yaitu medium cair dan medium padat. Dimana perbedaan keduanya adalah pada persentase agar yang terkandung didalamnya. Setelah perebusan daging didapat substrat yang dibagi menjadi 2 bagian, dimana pengujian untuk fermentasi cair akan ditambahkan bakteri E.coli dengan menggunakan jarum ose yang dibiakkan selama 12 jam sehingga tampak perubahan kekeruhan pada media. Ini menandakan bahwa substrat daging pada medium cair telah terhidrolisis. Pada medium padat dilakukan perlakuan sedikit berbeda, yaitu dengan menambahkan 3 gram agar untuk pemadat dan diberi bakteri asam laktat. Sehingga jika ditunggu selama kurang lebih 15 jam akan didapatkan zona bening.

            Prosedur kertas cakram merupakan cara untuk menentukan sensitifitas antibiotik untuk bakteri. Sensitifitas suatu bakteri terhadap antibiotik ditentukan oleh diameter zona hambat yang terbentuk. Semakin besar diameternya maka akan semakin terhambat pertumbuhannya.

            Dari dua variasi yang digunakan dalam praktikum zona bening ini yakni variasi waktu dengan menggunakan bakteri asam laktat didapatkan nilai indeks zona bening yang tertinggi ialah pada waktu 40 dan 60 s, seharusnya indeks zona bening tertinggi ialah 80 s, karena berbanding lurus. Dimana semakin lama waktu perendaman paperdisc ke dalam BAL maka seharusnya indeks zona bening yang di dapat juga besar. Begitu juga dengan variasi  antibiotik pada penambahan/penentuan fermentasi media padat ini digunakan antibiotik dengan berbagai massa dan pada waktu perendaman yang sama yaitu 60 s. sehingga didapat juga indeks bias yang paling tinggi pada A₃₀.

V.     KESIMPULAN DAN SARAN

5.1  Kesimpulan

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan sebagai berikut :

1.         Bakteri akan terhambat oleh adanya aktivitas enzim dari bakteri asam laktat.

2.         Didapatkan zona bening sehingga dapat diketahui indeks zona bening dan diameternya.

3.         Terdapat perbedaan kekeruhan dari fermentasi cair yang ditambahkan bakteri E.coli dengan memakai jarum ose.

4.         Autoclave berguna untuk mensterilkan peralatan dan medium agar terhindar dari pengaruh senyawa lain yang tidak diinginkan.

5.2  SARAN

Agar praktikum selanjutnya berjalan dengan lancer, disarankan kepada praktikan untuk :

1.         Membersihkan tangan dengan alkohol agar semua alat yang digunakan steril.

2.         Memahami prosedur kerja.

3.         Melakukan praktikum dengan hati-hati.

4.         Pilih kertas cakram yang tebal.

JAWABAN PERTANYAAN

1.      Apa yang dimaksud dengan zona bening?

Zona bening adalah suatu metoda dalam penetuan tingkat resistansi atau area tingkat bening disekeliling kertas cakram sebagai indikasi tidak adanya atau terhambatnya pertumbuhan mkroorganisme akibat ekstraksi zat anti mikroba oleh kompetitornya.

2.      a. Maksud fermentasi berdasarkan biokimia dan mikrobiologi !

Fermentasi berdasarkan biokimia yaitu segala proses metabolisme (enzim, jasad renik secara oksidasi, reduksi, hidrolisa/reaksi kimia lainnya) yang melakukan perubahan kimia pada suatu substrat organik dengan menghasilkan produk.

Fermentasi berdasarkan mikrobiologi yaitu aplikasi metabolisme mikroba untuk mengubah bahan baku menjadi produk yang bernilai tinggi.

b. Jelaskan macam-macam fermentasi !

-      Fermentasi alkohol

Beberapa jasad renik seperti ragi, glukosa dioksidasi menghasilkan etanol dan CO₂.

-      Fermentasi asam laktat

Fermentasi ini banyak dilakukan fungi dan bakteri tertentu. Dalam industri susu dugunakan untuk membuat keju dan yoghurt.

-      Fermentasi propionat

Propionat merupakan produk akhir fermentasi gula dan pati. Sebagian besar energi yang dibutuhkan untuk pertumbuhan dan produksi laktosa diperoleh dari propionat.

-      Fermentasi butirat

Dilakukan oleh Clostridium sp yang merupakan bakteri penghasil spora heterogenus sebagai sakarolitik dan proteolitik.

3.      Aplikasi / hasil dari fermentasi !

a.       Proses fermentasi untuk memproduksi sel mikroba. Yang termasuk tipe ini adalah produk Beaker Yeast dan produksi sel tunggal.

b.       Proses fermentasi untuk memproduksi enzim. Contohnya produksi protease, amilase, pektinase, dll.

c.       Proses fermentasi untuk memproduksi metabolit sekunder dan metabolit primer. Yang termasuk metabolit sekunder adalah steroid, antibiotik, dsb. Yang termasuk metabolit primer adalah alkohol, asam sitrat, butanol, aseton.

d.       Proses fermentasi untuk memodifikasi senyawa kimia tertentu menjadi produk yang lebih mempunyai nilai ekonomi.

Contoh : anhidrotetrasiklin                tetrasiklin

               naftalen                               asam salisilat

4.      Metoda-metoda penentuan zona bening !

a.       Metoda cakram

Metoda yang biasa digunakan untuk menguji aktivitas mikroba suatu antiniotik terhadap mikroorganisme patogen penyebab penyakit.

b.       Metoda sumur agar

5.      Jelaskan keuntungan dari fermentasi cair !

-      Hampir disemua bagian tangki terjadi fermentasi.

-      Kontak antar reaktan dan bakteri semakin besar.

-      Produk merupakan produk pekat yang kaya akan gizi, mengandung mineral, vitamin dan hormon pertumbuhan.

DAFTAR PUSTAKA

1.      Syukur, Sumaryati, Prof. Dr. Bioteknologi Probiotik Untuk Kesehatan Masyarakat. ANDI : Yogyakarta

2.      Lehninger, Nelson dan Cox. 1992. Principle Of Biochemistry. Worth Publiser: New York

3.      Rusmana, Iman. 2008. Sistem Operasi Fermentasi. Departemen Biologi FMIPA IPB : Bogor

4.      Sumarsih, Sri. 2003. Diktat Kuliah Mikrobiologi Dasar. Fakultas Pertanian UPN “VETERAN” : Yogyakarta